Impact of histone H4 lysine 20 methylation on 53BP1 responses to chromosomal double strand breaks.

Recruitment of 53BP1 to chromatin flanking double strand breaks (DSBs) requires γH2AX/MDC1/RNF8-dependent ubiquitination of chromatin and interaction of 53BP1 with histone H4 methylated on lysine 20 (H4K20me). Several histone methyltransferases have been implicated in 53BP1 recruitment, but their quantitative contributions to the 53BP1 response are unclear. We have developed a multi-photon laser (MPL) system to target DSBs to subfemtoliter nuclear volumes and used this to mathematically model DSB response kinetics of MDC1 and of 53BP1. In contrast to MDC1, which revealed first order kinetics, the 53BP1 MPL-DSB response is best fitted by a Gompertz growth function. The 53BP1 MPL response shows the expected dependency on MDC1 and RNF8. We determined the impact of altered H4K20 methylation on 53BP1 MPL response kinetics in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking key H4K20 histone methyltransferases. This revealed no major requirement for the known H4K20 dimethylases Suv4-20h1 and Suv4-20h2 in 53BP1 recruitment or DSB repair function, but a key role for the H4K20 monomethylase, PR-SET7. The histone methyltransferase MMSET/WHSC1 has recently been implicated in 53BP1 DSB recruitment. We found that WHSC1 homozygous mutant MEFs reveal an alteration in balance of H4K20 methylation patterns; however, 53BP1 DSB responses in these cells appear normal

Atomic force microscopy sees nucleosome positioning and histone H1-induced compaction in reconstituted chromatin

AbstractWe addressed the question of how nuclear histones and DNA interact and form a nucleosome structure by applying atomic force microscopy to an in vitro reconstituted chromatin system. The molecular images obtained by atomic force microscopy demonstrated that oligonucleosomes reconstituted with purified core histones and DNA yielded a ‘beads on a string’ structure with each nucleosome trapping 158±27 bp DNA. When dinucleosomes were assembled on a DNA fragment containing two tandem repeats of the positioning sequence of the Xenopus 5S RNA gene, two nucleosomes were located around each positioning sequence. The spacing of the nucleosomes fluctuated in the absence of salt and the nucleosomes were stabilized around the range of the positioning signals in the presence of 50 mM NaCl. An addition of histone H1 to the system resulted in a tight compaction of the dinucleosomal structure

DNA methyltransferase 3b preferentially associates with condensed chromatin

In mammals, DNA methylation is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs) encoded by Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b. Since, the mechanisms of regulation of Dnmts are still largely unknown, the physical interaction between Dnmt3b and chromatin was investigated in vivo and in vitro. In embryonic stem cell nuclei, Dnmt3b preferentially associated with histone H1-containing heterochromatin without any significant enrichment of silent-specific histone methylation. Recombinant Dnmt3b preferentially associated with nucleosomal DNA rather than naked DNA. Incorporation of histone H1 into nucleosomal arrays promoted the association of Dnmt3b with chromatin, whereas histone acetylation reduced Dnmt3b binding in vitro. In addition, Dnmt3b associated with histone deacetylase SirT1 in the nuclease resistant chromatin. These findings suggest that Dnmt3b is preferentially recruited into hypoacetylated and condensed chromatin. We propose that Dnmt3b is a ‘reader’ of higher-order chromatin structure leading to gene silencing through DNA methylation

Auditory hair cell defects as potential cause for sensorineural deafness in Wolf-Hirschhorn syndrome

WHSC1 is a histone methyltransferase (HMT) that catalyses the addition of methyl groups to lysine 36 on histone 3. In humans, WHSC1 haploinsufficiency is associated with all known cases of Wolf-Hirschhorn syndrome (WHS). The cardinal feature of WHS is a craniofacial dysmorphism, which is accompanied by sensorineural hearing loss in 15% of individuals with WHS. Here, we show that WHSC1-deficient mice display craniofacial defects that overlap with WHS, including cochlea anomalies. Although auditory hair cells are specified normally, their stereocilia hair bundles required for sound perception fail to develop the appropriate morphology. Furthermore, the orientation and cellular organisation of cochlear hair cells and their innervation are defective. These findings identify, for the first time, the likely cause of sensorineural hearing loss in individuals with WHS

Role of DNA topoisomerase II on transcription of the homeobox gene Hox-2.1 in F9 cells

　ショウジョウバエの発生､分化に関わる遺伝子から見いだされたホメオボックスと呼ばれる領域は､その後の研究よりマウスやヒトを含む脊椎動物にも存在することが明らかになった｡マウスの場合およそ35個のホメオボックス遺伝子が､100kb以上にわたる4つのクラスター(Hoxクラスター)を形成し､発生分化に伴い時期及び空間特異的に発現する｡一つのクラスター内でホメオボックス遺伝子の発現を比較すると､いずれも同じ方向に転写され､しかも染色体上の並び順に従う発現を示す｡このようなホメオボックス遺伝子の発現制御にクロマチン構造が深く関与する可能性を検証する目的で､ホメオボックス遺伝子の一つHox-2.1遺伝子の発現制御にDNAのトポロジーを変えるトポイソメラーゼII(トポII)が関与するのかを調べている｡　マウスのテラトカルシノーマの一種F9細胞を､レチノイン酸とジブチリルcAMPで処理すると3日から5日で壁側内胚葉に分化する｡この分化に伴うHox-2.1遺伝子の発現を､Northernhybridizationにより調べたところ､未分化なF9細胞では全くHox-2.1遺伝子の発現は見られないが､分化誘導すると4時間後には､2.1kbのHox-2.1mRNAが出現し､1日目にその蓄積はピークに達し､以後減少して5日目にはほとんど消失した｡さらに､未分化F9細胞および4時間分化誘導したF9細胞から核を単離してRun-ontranscription実験により進行中の転写を調べたところ､未分化F9細胞においてもHox-2.1遺伝子は低いレベルで転写されており､分化誘導すると4時間後には転写活性が5倍上昇することが明らかになった｡このことからF9細胞の分化に伴うHox-2.1遺伝子の発現誘導は少なくとも遺伝子の転写の活性化によると結論できる｡　次にこの遺伝子の転写制御にトポIIが関与しているのか調べるために､トポIIの阻害剤であるエトポシドの効果を調べている｡F9細胞の分化誘導時にエトポシドを加えると､薬剤濃度を増すに従い4時間後のHox-2.1mRNAの蓄積は減少し､100μMのエトポシドではHox-2.1遺伝子の発現はほとんど見られない｡一方､hsp70とβ-アクチンのmRNA量は全く変化が見られない｡同様の現象は異なるトポII阻害剤､mAMSAを用いても見られている｡エトポシドとmAMSAは構造および作用機構が大きく異なっており､両者で同じ現象が見られたことから､薬剤によるHox-2.1遺伝子の発現抑制はトポIIが阻害された結果と想定される｡次にHox-2.1遺伝子の発現が抑制されたのは､トポIIを阻害することによりHox-2.1遺伝子の転写が抑制されたためか､あるいは､mRNAの分解が促進されたためか､両可能性を検討するためにRun-ontranscription実験及び､アクチノマイシンDを用いた実験を行なっている｡4時間分化させる際に､エトポシドを加えた細胞及び加えなかった細胞から核を単離し､Run-ontranscriptionの実験が行われた｡両者を比較すると[32P] CMPの核RNAへの取り込みに差はほとんど見られないが､Hox-2.1遺伝子の転写活性はトポII阻害により未分化細胞の転写レベルまで抑制された｡一方hsp70やc-fos､ラミニンB1,そしてβ-アクチン遺伝子の転写活性は､ほとんど影響を受けなかった｡従ってトポII阻害によるHOX-2.1mRNA蓄積の減少は､少なくともHox-2.1遺伝子の転写が抑制された結果と結論付けられている｡7時間分化誘導してHox-2.1mRNAがある程度蓄積している時点でアクチノマイシンDを加え新たなmRNAの合成を阻害した場合､エトポシド添加の有無によらずそれ以降のmRNA量の変化に差は見られない｡従って一旦合成されたmRNAの安定性には､トポIIを阻害することは影響しないと結論されている｡　Hox-2.1遺伝子の転写制御にトポIIが関与していることを示した後に､トポIIが作用してHox-2.1遺伝子の発現を制御している部位をDNA上に特定するため､エトポシドを用いてトポ11によるDNA切断部位をHox-2.1遺伝子周辺に探している｡エトポシドはトポIIとDNAの共有結合中間体を安定化させるため､除蛋白により生体内でトポIIがDNA上作用していた部位を切断する｡Hox-2.1遺伝子を含む23kbの領域についてトポII切断部位を調べ､Hox-2.1遺伝子の3’末端から5.8kb下流に､ただ一ケ所だけ切断部位を見い出している｡この切断部位は､細胞の分化によらず常に存在する｡この部位がHox-2.1遺伝子の発現を調節している部位であるかは､遺伝子導入などこの領域の機能解折により調べることが可能となった｡　トポIIがF9細胞の分化に伴ってHox-2.1遺伝子の転写を制御する機構として次のようなモデルを提唱している｡一つは､Hox-2.1遺伝子のプロモーター活性が､DNAのスーパーコイルの程度による影響を強く受け､生体内で局所的にスーパーコイルの程度をトポIIが調節して遺伝子を活性化する機構である｡実際､in vitro転写系を用いた実験では発生分化に関わる遺伝子のプロモーターはスーパーコイル化の影響を強く受ける結果を得ており､真核生物のトポIIは､所属研究グループが精製したスーパーコイル化因子とトポIIが協調してin vitroでDNAに負のスーパーコイルを導入する活性を有している｡もう一つの可能性は､トポIIがHox-2.1遺伝子を含む不活性なクロマチンドメインを解いて活性化する機構である｡遺伝学的にも生化学的にも､トポIIは細胞分裂に伴うクロマチンの高次構造変化に必要な酵素であることがすでに示されているので､遺伝子活性化に伴うクロマチンドメインの高次構造変化をトポIIが制御している可能性を提唱している｡遺伝子の転写制御に果たすトポIIの役割を明かにしようとする試みは､これまでほとんど研究がなされていないクロマチンの高次構造変化による遺伝子発現制御の機構を解明する糸口になると想定される

Additional file 1 of Construction and applications of exon-trapping gene-targeting vectors with a novel strategy for negative selection

Table S1. Oligonucleotides used in this study. Figure S1. Construction of pENTR lox71-P. Figure S2. Construction of pDEST SA-IRES-DTA-pA. Figure S3. Schematic representation of exon-trapping gene targeting at the mouse Rosa26 and human HPRT loci